2.1  实验动物数量分析  所有实验动物无死亡或感染。所有取材标本均纳入实验无脱失。

2.2  各组关节软骨苏木精-伊红染色光学显微镜下形态学观察及Mankin’s评分  手术干预后第14周，空白组大体观：膝关节软骨色泽正常、光滑、无损伤；苏木精-伊红染色下软骨细胞排列规则，潮线完整，见图1A。模型组大体观：可见膝关节软骨有缺损及骨质外露；苏木精-伊红染色下可见细胞排列紊乱，软骨下血管增生明显，见图1B。枸杞多糖组大体观：可见软骨表面欠光滑；苏木精-伊红染色见软骨细胞排列整齐潮线较完整，见图1C。生理盐水组大体观：关节软骨有表浅裂隙；苏木精-伊红染色可见细胞排列不规则，软骨细胞凋亡，潮线欠完整，见图1D。

空白组、模型组、枸杞多糖组及生理盐水组的Mankin’s评分分别为0，(7.27±0.69)，(2.02±0.38)及(7.13±0.70)分，其中枸杞多糖组Mankin’s评分低于模型组(P < 0.05)。

2.3  各组关节软骨免疫组织化学染色及吸光度值变化  各组关节软骨CD151及MMP-3吸光度值见表2。

免疫组织化学染色显示：空白组中未见CD151及MMP-3的阳性表达，只有背景着色，见图2A1，2B1，模型组有可见CD151及MMP-3高表达，大部分位于表层与中层，见图2A2，2B2；枸杞多糖组中可见CD151及MMP-3的低度阳性表达，大部分位于表层，少部分位于中层，见图2A3，2B3，与模型组对比差异有显著性意义(P < 0.05)，生理盐水组中可见CD151及MMP-3强阳性表达主要位于表层及中层，见图2A1，2B1，与模型组比较无显著性意义(P > 0.05)。

2.4  各组CD151及MMP-3蛋白在关节软骨中的表达Western blot检测显示，各组中均有CD151及MMP-3蛋白表达，二者在空白组中呈低度表达，在枸杞多糖组中CD151及MMP-3蛋白表达低于生理盐水组(P < 0.05)，见图3。

膝骨关节炎是一种临床中常见的关节退行性疾病，其中以关节软骨退变为主要病理变化。该病的具体发病机制尚不完全清楚，其中组成关节软骨的软骨细胞的变性与凋亡在膝骨关节炎的发生与发展中起着关键作用^[1-3]。目前认为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)通过降解关节软骨中的胶原成分和蛋白聚糖促进骨性关节炎的发生^[4]；最新的研究认为CD151通过活化MMPs产生瀑布放大效应，加速关节软骨的破坏，促进膝骨关节炎 的发生^[5]。枸杞多糖是枸杞的主要成分，具有抗老化、保护神经、抗疲劳、控制血糖、抗氧化及抗肿瘤等作用^[6-9]。

实验将枸杞多糖作用于兔膝骨关节炎模型，观察软骨形态变化及MMP-3及CD151表达水平变化，以探讨膝骨关节炎发生的可能机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2014年3月至2016年10月在宁夏医科大学中心实验室完成。

1.3  材料  健康6月龄大耳白兔64只，雌雄各32只，体质量2.0-2.5 kg，由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(宁)2011-0001。实验于2014年1月经宁夏人民医院动物伦理委员会批准(批准号：2014-30817)。

1.4  实验方法

1.4.1  实验动物分组  应用随机数字表法将64只大耳白兔分为空白组、模型组、枸杞多糖组及生理盐水组，每组16只。除空白组外余各组均以Hulth法复制膝骨关节炎模型^[10]，术后8周行病理学检查明确造模是否成功(Mankin’s软骨退变分级标准^[11])。

1.4.2  构建动物模型  采用Hulth法建立膝骨关节炎兔模型^[10]，耳缘静脉麻醉，在兔左膝关节内侧切开关节并切断前交叉韧带及内侧半月板，依次缝合关节。术后患肢不固定，实验动物分笼饲养。术后常规肌肉注射青霉素预防感染。

1.4.3  术后观察并药物干预  术后8周，模型组不予以药物处理，枸杞多糖组予以质量浓度50 g/L的枸杞多糖(宁夏启元药业)溶液灌胃，剂量为200 mg/(kg • d)，连续6周，生理盐水组予以生理盐水等剂量[4 mL/(kg • d)]灌胃，连续6周，记录实验动物一般情况。

1.4.4  标本采集  干预后第14周将各组大耳白兔麻醉后，取出兔左股骨内侧髁软骨组织，置于液氮低温保存，以备切片染色及蛋白检测。

1.4.5  制备病理切片  将标本组织多聚甲醛中固定并脱钙10 d，行冰冻切片。

1.4.6  苏木精-伊红染色及软骨退变评分  苏木精-伊红先后染色后，常规脱水、透明、封固，于光学显微镜下观察软骨组织结构、细胞数量和潮线完整性，按照Mankin’s软骨退变分级标准进行评分^[11]，见表1。

1.4.7  免疫组织化学染色及评分  干预后第14周将各组大耳白兔麻醉后，取出兔左股骨内侧髁软骨组织，置于液氮低温保存，以备切片染色及检测。

制备病理切片：将各组部分软骨组织置于40 g/L的多聚甲醛中固定过夜，体积分数10%的EDTA脱钙10 d，行冰冻切片，片厚10 μm，置于-20 ℃冰箱中保存。

苏木精-伊红染色及软骨退变评分：苏木精、伊红先后染色后，常规脱水、透明、封固，于光学显微镜下观察软骨组织结构、细胞数量和潮线完整性，各组冰冻切片免疫组织化学染色，抗体为羊抗兔CD151(碧云天公司；1∶400)，驴抗兔MMP-3(碧云天公司；1∶300)。综合染色强度及阳性细胞分布确定CD151及MMP-3在软骨中的表达水平。

评分标准(Mankin’s软骨退变分级标准^[11])：①染色强度：无染色或染色不清者为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色或褐色为3分；②阳性细胞百分率：阳性细胞百分数<10%为0分，15%-25%为1分，25%-50%为2分，>50%为3分；③每份切片计分等于以上二项分数的乘积，0-1分为阴性(-)，2-3分为弱阳性(+)，4-5分为中度阳性(++)，>5分为强阳性(+++)。

 应用Image-Pro plus 5.1专业图像分析系统对染色切片中的阳性部分测量其平均吸光度值，从而对CD151与MMP-3在软骨中的表达情况进行衡量。

1.4.8  Western Blot法检测兔膝关节软骨CD151及MMP-3蛋白的表达  干预后第14周将各组大耳白兔麻醉后，取出兔左股骨内侧髁软骨组织，置于液氮低温保存，以备蛋白检测。抗体信息见1.4.7描述，一抗孵育：取出PVDF膜，将其放置于另一小袋中，加入用封闭液稀释的一抗1∶100，4 ℃摇床过夜。TBST洗膜：5 min×5次，室温摇床。二抗孵育：将膜转移至新的小袋中，加入封闭液按1∶5 000稀释的二抗，室温，反应1 h。TBST洗膜：5 min ×3次，室温摇床。曝光、洗片：用ECL法显色，X射线胶片压片曝光。用凝胶图像成像系统进行扫描拍照，以CD151/β-actin和MMP-3/β-actin代表蛋白的相对表达水平。

1.5  主要观察指标  各组兔膝关节软骨免疫组织化学染色形态、CD151及MMP-3蛋白的表达。

1.6  统计学分析  实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料采用x(_)±s表示，组间数据采用单因素方差分析比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

膝关节骨性关节炎的发生与机体的多种原因有关。目前的理论认为，关节内的炎性反应、细胞凋亡、细胞外基质在膝关节骨性关节炎的发生发展过程中起到了非常重要的作用。在研究膝关节骨性关节炎的基础研究中，动物实验具有举足轻重的作用。

3.1  动物模型构建  研究膝骨关节炎发生的病理机制及相关治疗方法，需要成熟的实验动物模型进行实验。目前已经有多种成熟的方法构建膝骨关节炎实验动物模型，其主要的作用机制是通过外界改变促进软骨的退变从而继发相关关节疾病，其中主要的两种手段是：诱导引发膝骨关节炎和自发引起膝骨关节炎，目前较多使用的是诱导引法膝骨关节炎。兔的膝关节因与人类膝关节结构类似，同时关节较大，适合手术操作，成为目前研究膝骨关节炎的主要实验动物。目前制备膝骨关节炎动物模型的主要方法是通过侵入性手术切除兔膝关节的前交叉韧带及内侧半月板，达到影响关节稳定的作用，术后造成膝关节不稳从而逐渐引发膝骨关节炎，此方法是目前较为常用的造模方法。实验就采用了此种方法进行模型的制备，该方法制备方便，对实验动物的干扰较小，可以比较完整的反映膝关节退变的过程。实验造模成功后可见膝关节大体标本中关节软骨部分脱落，软骨下骨外露，骨赘形成，关节表面糜烂、凹凸不平、部分骨质缺损，可见骨质外露及骨赘形成，这些变化符合骨关节炎的病理改变，与方锐等^[12]研究结果相一致，也证明此次研究成功制作了膝骨关节炎模型。同时动物实验造模表明，在膝关节骨性关节炎中，关节软骨的胶原分子等发生了破坏，其CD151及MMP-3的表达均发生了改变，说明膝关节骨性关节的发病与CD151及MMP-3的表达有关，也从侧面证明了该动物模型的可靠。

3.2  枸杞多糖对模型动物关节软骨退变的影响  枸杞多糖是枸杞中最重要的有效成分，具有抗老化、保护神经、抗疲劳、控制血糖、抗氧化及抗肿瘤等作用，并且可以增强机体免疫力。有研究表明枸杞多糖通过抑制核转录因子κB信号通路保护血管内皮细胞增殖活性与分泌功能^[13]。戚筠等^[14]发现质量浓度100，200 mg/L的枸杞多糖可使MIN6细胞增殖显著增加。李小璐等^[15]发现枸杞多糖可调节血管内皮生长因子的表达与生成，从而减轻糖尿病造成的大鼠视网膜血管形态改变，改善其血-视网膜屏障。GAO等^[7]研究发现枸杞多糖可通过扭转海马神经元凋亡与再生的不平衡从而扭转其创伤后认知。BIE等^[8]发现枸杞多糖能通过调节自噬从而提高双向对冲电流，诱导小胶质细胞损伤。LUO等^[9]发现枸杞多糖能改善暴露于低剂量电离辐射下导致的雄性大鼠生殖系统中精原细胞的凋亡。同时有学者研究发现枸杞多糖有抑制细胞凋亡、抑制氧化应激及炎症反应的作用^[16-20]。有学者还发现枸杞多糖通过抑制核转录因子κB、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素1β对小鼠缺血再灌注损伤具有保护作用^[19]。

在骨性关节炎中MMPs具有非常重要的作用^[21]。MMPs家族经常在关节炎的病理发展过程中扮演非常重要的角色。关节软骨的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖是关节的重要基础物资，而MMPs可以直接破坏其结构，使得关节软骨的稳定性降低，最终使关节软骨降解，使软骨受到炎性因子的破坏，最终形成膝关节骨性关节炎。在以往的实验研究中发现，MMP-3在骨性关节炎患者体内较正常人要高。同时MMP-3通过促进关节腔细胞分泌多种炎性因子，导致关节软骨的细胞外基质破坏^[22-30]，其间接参与了整个关节软骨的病变过程。实验发现在动物模型关节软骨中的MMP-3表达较正常对照组是增高的，从侧面也印证了以往的实验。同时使用枸杞多糖后，实验动物模型MMP-3的表达较对照组有着明显的下降，提示枸杞多糖对MMP-3具有一定的抑制作用。

CD151作为近些年新发现的基因，具有一定的促进细胞增殖、促进肿瘤生长及增加肿瘤细胞迁移的作用，同时其对MMPs具有一定的活化作用，其在MMPs的表达中具有重要的作用。实验发现骨性关节炎动物模型标本内出现了CD151的增高，与此同时标本内MMP-3的表达也增加了，这说明CD151对MMP-3具有一定的正性促进作用。随着使用枸杞多糖后，两者的表达均出现了下降，但并不能说明枸杞多糖可以通过CD151来降低MMP-3的表达，这将是实验后面继续研究的一个方面。

实验认为：枸杞多糖可以调节机体在病理条件下某些相关因子的表达，从而维持机体所需的稳定的微环境，其对CD151和MMP-3的表达均有一定的影响，但具体是通过哪些途径进行的影响，还需要进一步的研究。目前国外乃至中国对枸杞多糖在改善膝骨关节炎中的治疗效果及作用机制研究甚少。实验认为枸杞多糖的干预，可以从分子水平对膝关节的软骨具有一定的保护作用；通过形态学及相关分子水平的检测，提示实验枸杞多糖具有抑制关节软骨退变的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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文题释义：

膝骨关节炎：是一种临床中常见的关节退行性疾病，其中以关节软骨退变为主要病理变化。

枸杞多糖：是从枸杞中提取而得的一种水溶性多糖。已明确该多糖系蛋白多糖，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖6种单糖成分组成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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实验将枸杞多糖作用于兔膝骨关节炎模型，观察软骨形态变化及MMP-3及CD151表达水平变化，以探讨膝骨关节炎发生的可能机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程